相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡?；罴?xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無(wú)法觀察。而相差顯微鏡通過(guò)改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏?lái)觀察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。

　　功能

　　相差顯微鏡具有兩個(gè)其他顯微鏡所不具有的功能:①將直射的光(視野中背景光)與經(jīng)物體衍射的光分開(kāi);②將大約一半的波長(zhǎng)從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)度的變化。

　　基本原理

　　利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過(guò)物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?光強(qiáng)度)的差別，經(jīng)過(guò)帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

　　把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng))，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。

　　幾個(gè)問(wèn)題

　　(1)相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’n時(shí)得到象的明暗反差正好相反，稱(chēng)為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時(shí)是無(wú)法識(shí)別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會(huì)出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時(shí)，這個(gè)轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時(shí)約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。

　　(2)暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過(guò)程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時(shí)，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會(huì)在較暗物體的周?chē)霈F(xiàn)一個(gè)明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點(diǎn)，它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時(shí)暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相差顯微鏡的另一個(gè)現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時(shí)，該區(qū)域邊緣會(huì)出現(xiàn)反差下降。

　　(3)樣品厚度的影響 當(dāng)進(jìn)行相差觀察時(shí)，樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄，當(dāng)采用較厚的樣品時(shí)，樣品的上層是很清楚的，深層則會(huì)模糊不清并且會(huì)產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。

　　(4)蓋玻片和載玻片的影響 樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對(duì)載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求，當(dāng)有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時(shí)會(huì)產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過(guò)厚或過(guò)薄時(shí)會(huì)使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。

　　特殊構(gòu)造

　　在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡2個(gè)特殊之處：

　　1.環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

　　2.相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

　　(1)A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變亮，形成亮反差(或稱(chēng)負(fù)反差)。

　　(2)B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差(或稱(chēng)正反差)，結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變暗。

　　3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。

　　4.綠色濾光片：縮小照明光線波長(zhǎng)范圍，減少由于照明光線的波長(zhǎng)不同引起的相位變化。