第一章： 顯微鏡簡史

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們越來越需要觀察微觀世界，顯微鏡正是這樣的設(shè)備，它突破了人類的視覺極限，使之延伸到肉眼無法看清的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

顯微鏡是從十五世紀(jì)開始發(fā)展起來。從簡單的放大鏡的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出來的單透鏡顯微鏡，到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的復(fù)式顯微鏡，以及相差，熒光，偏光，顯微觀察方式的出現(xiàn)，使之更廣范地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，金屬材料，化工等領(lǐng)域。

第二章 顯微鏡的基本光學(xué)原理

一． 折射和折射率

光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時(shí)，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。

二． 透鏡的性能

透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。

當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱“焦點(diǎn)”，通過交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱“焦平面”。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱“物方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“物方焦平面”；反之，在象方空間的焦點(diǎn)，稱“象方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“象方焦平面”。

光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來，而虛像不能。
 
三． 影響成像的關(guān)鍵因素—相差

由于客觀條件，任何光學(xué)系統(tǒng)都不能生成理論上理想的象，各種象差的存在影響了成像質(zhì)量。下面分別簡要介紹各種相差。

1． 色差（Chromatic aberration）

色差是透鏡成像的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，發(fā)生在多色光為光源的情況下，單色光不產(chǎn)生色差。白光由紅 橙 黃 綠 青 藍(lán) 紫 七種組成，各種光的波長不同 ，所以在通過透鏡時(shí)的折射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在象方則可能形成一個(gè)色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察，都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣

2． 球差(Spherical aberration)

球差是軸上點(diǎn)的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不在是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮 邊緣逐漸模糊的亮斑。從而影響成像質(zhì)量。

球差的矯正常利用透鏡組合來消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的，可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來給予消除。舊型號顯微鏡，物鏡的球差沒有完全矯正，應(yīng)與相應(yīng)的補(bǔ)償目鏡配合，才能達(dá)到糾正效果。一般新型顯微鏡的球差完全由物鏡消除。

3． 慧差(Coma)

慧差屬軸外點(diǎn)的單色相差。軸外物點(diǎn)以大孔徑光束成象時(shí)，發(fā)出的光束通過透鏡后，不再相交一點(diǎn)，則一光點(diǎn)的象便會得到一逗點(diǎn)壯，型如慧星，故稱“慧差”。

4． 象散（Astigmatism）

象散也是影響清晰度的軸外點(diǎn)單色相差。當(dāng)視場很大時(shí)，邊緣上的物點(diǎn)離光軸遠(yuǎn)，光束傾斜大，經(jīng)透鏡后則引起象散。象散使原來的物點(diǎn)在成象后變成兩個(gè)分離并且相互垂直的短線，在理想象平面上綜合后，形成一個(gè)橢圓形的斑點(diǎn)。象散是通過復(fù)雜的透鏡組合來消除。

5． 場曲（Curvature of field）

場曲又稱“象場彎曲”。當(dāng)透鏡存在場曲時(shí)，整個(gè)光束的交點(diǎn)不與理想象點(diǎn)重合，雖然在每個(gè)特定點(diǎn)都能得到清晰的象點(diǎn)，但整個(gè)象平面則是一個(gè)曲面。這樣在鏡檢時(shí)不能同時(shí)看清整個(gè)相面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場物鏡，這種物鏡已經(jīng)矯正了場曲；。

6． 畸變（Distortion）

前面所說各種相差除場曲外，都影響象的清晰度。畸變是另一種性質(zhì)的相差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響象的清晰度，但使象與原物體比，在形狀上造成失真。

三 顯微鏡的成象（幾何成象）原理

顯微鏡之所以能將被檢物體進(jìn)行放大，是通過透鏡來實(shí)現(xiàn)的。單透鏡成象具有象差，嚴(yán)重影響成象質(zhì)量。因此顯微鏡的主要光學(xué)部件都由透鏡組合而成。從透鏡的性能可知，只有凸透鏡才能起放大作用，而凹透鏡不行。顯微鏡的物鏡與目鏡雖都由透鏡組合而成，但相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡。為便于了解顯微鏡的放大原理，簡要說明一下凸透鏡的5種成象規(guī)律：

（1） 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象；
（2） 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象；
（3） 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象；
（4） 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象；
（5） 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。

顯微鏡的成象原理就是利用上述（3）和（5）的規(guī)律把物體放大的。當(dāng)物體處在物鏡前F-2F（F為物方焦距）之間，則在物鏡象方的二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象。在顯微鏡的設(shè)計(jì)上，將此象落在目鏡的一倍焦距F1之內(nèi)，使物鏡所放大的第一次象（中間象），又被目鏡再一次放大，最終在目鏡的物方（中間象的同側(cè)）、人眼的明視距離（250mm）處形成放大的直立（相對中間象而言）虛象。因此，當(dāng)我們在鏡檢時(shí)，通過目鏡（不另加轉(zhuǎn)換棱鏡）看到的象于原物體的象，方向相反。

四．顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)簡介

顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)有三種光學(xué)系統(tǒng)。

1 長筒光學(xué)系統(tǒng)

2 萬能無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)：是目前最先進(jìn)的光路設(shè)計(jì)，它分體現(xiàn)了無限遠(yuǎn)校正方式的優(yōu)越性。光線通過物鏡后成為平行光束通過鏡筒，并在結(jié)象透鏡處折射或完成無相差的中間象。物鏡與觀察筒內(nèi)結(jié)象透鏡之間可添加光學(xué)附件，而不影響總放大倍數(shù)。另外這種光學(xué)系統(tǒng)不需要安裝附加校正透鏡，都能得到最佳的顯微圖象。

第三章 顯微鏡的重要光學(xué)技術(shù)參數(shù)

在鏡檢時(shí)，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且要求在使用時(shí)，必須根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿意的鏡檢效果。

顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。

一． 數(shù)值孔徑

數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)科在物鏡和聚光鏡的外殼上。

數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（h）和孔徑角（u）半數(shù)的正玄之乘積。用公式表示如下：

NA=hsinu/2

孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱螅M(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。

顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率h值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率h值大于一，NA值就能大于一。

數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。

這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值，

數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應(yīng)地變小。

二． 分辨率

分辨率又稱“鑒別率”，“解像力”。是衡量顯微鏡性能的又一個(gè)重要技術(shù)參數(shù)。

顯微鏡的分辨率用公式表示為：d=l/NA

式中d為最小分辨距離；l為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則d值越小，分辨率就越高。

要提高分辨率，即減小d值，可采取以下措施

1． 降低波長l值，使用短波長光源。
2．曾大介質(zhì)h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔徑角。
4．增加明暗反差。

三． 放大率

放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢驗(yàn)物體經(jīng)物鏡放大再經(jīng)目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小對原物體大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。

放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好，在選擇時(shí)應(yīng)首先考慮物鏡的數(shù)值孔徑。

四． 焦深

焦深為焦點(diǎn)深度的簡稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：

1．焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。
2．焦深大，分辨率降低。

由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時(shí)造成困難。在顯微照相時(shí)將詳細(xì)介紹。

五． 視場直徑（Field of view）

觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的原形范圍叫視場，它的大小，是由目鏡里的視場光闌決定的。

視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。

F=FN/Mob

F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)，Mob:物鏡放大率。

視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN），標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)。

由公式可看出：

1． 視場直徑與視場數(shù)成正比。
2． 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

六． 覆蓋差

顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。

國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm, 許可范圍在0.16—0.18mm.,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)科的確0.17,即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。

七． 工作距離

工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。

在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。

數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。

第四章 顯微鏡的光學(xué)附件

顯微鏡得不償失光學(xué)部件包括物鏡，目鏡，聚光鏡及照明裝置幾個(gè)部分。各光學(xué)部件都直接決定和影響光學(xué)性能的優(yōu)劣，現(xiàn)分述如下：

一．物鏡

物鏡是顯微鏡最重要的光學(xué)部件，利用光線使被檢物體第一次成象，因而直接關(guān)系和影響成象的質(zhì)量和各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質(zhì)量的首要標(biāo)準(zhǔn)。

物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制作精密，由于對象差的校正，金屬的物鏡筒內(nèi)由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸,齊焦。

齊焦既是在鏡檢時(shí)，當(dāng)用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉(zhuǎn)換另一倍率的物鏡時(shí)，其成象亦應(yīng)基本清晰，而且象的中心偏離也應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，它是與物鏡的本身質(zhì)量和物鏡轉(zhuǎn)換器的精度有關(guān)。

物鏡的種類很多，可從不同的角度分類，現(xiàn)分類介紹。

根據(jù)物鏡相差校正的程度進(jìn)行分類，可分為：

1．消色差物鏡（Achromatic objective）: 這是常見的物鏡，外殼上常有“Ach”字樣。這類物鏡僅能校正軸上點(diǎn)的位置色差（紅，藍(lán)二色）和球差（黃綠光）以及消除近軸點(diǎn)慧差。不能校正其它色光的色差和球差，且場曲很大。

2．復(fù)消色差物鏡（Apochromatic objective）: 復(fù)消色差物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標(biāo)有“Apo” 字樣 ，這種物鏡不僅能校正紅綠藍(lán)三色光的色差，同時(shí)能校正紅，藍(lán)二色光的球差。由于對各種相差的校正極為完善，比響應(yīng)倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質(zhì)量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復(fù)消色差物鏡的性能很高，適用于高級研究鏡檢和顯微照相.

3．半復(fù)消色差物鏡（ Semi apochromatic objedtive）: 半復(fù)消色差物鏡又稱氟石物鏡，物鏡，物鏡的外殼上標(biāo)有“FL”字樣，在結(jié)構(gòu)上透鏡的數(shù)目比消色差物鏡多，比負(fù)消色差物鏡少，成象質(zhì)量上，遠(yuǎn)較消色差物鏡為好，接近于復(fù)消色差物鏡。平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達(dá)到校正場曲的缺陷。平場物鏡的視場平坦，更適用于鏡檢和顯微照象。

4．特種物鏡：所謂“特種物鏡”是在上述物鏡的基礎(chǔ)上，專門為達(dá)到某些特定的觀察效果而設(shè)計(jì)制造的。主要有以下幾種：

（1） 帶校正環(huán)物鏡（Correction collar objective）:
在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調(diào)節(jié)環(huán)，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)環(huán)時(shí)，可調(diào)節(jié)物鏡內(nèi)透鏡組之間的距離，從而校正由蓋玻片厚度不標(biāo)準(zhǔn)引起的覆蓋差。調(diào)節(jié)環(huán)上的刻度可從0 .11--.023,在物鏡的外殼上也標(biāo)科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從0.11—0.23mm厚度之間的誤差。

（2） 帶虹彩光闌的物鏡（Iris diaphragm objective ）:

在物鏡鏡筒內(nèi)的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)可調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，這種結(jié)構(gòu)的物鏡是高級的油浸物鏡，它的作用是在暗視場鏡檢時(shí)，往往由于某些原因而使照明光線進(jìn)入物鏡，使視場背景不夠黑暗，造成鏡檢質(zhì)量的下降。這時(shí)調(diào)節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強(qiáng)鏡檢效果。

（3）相襯物鏡（Phase contrast objective ）:
這種物鏡是由于相襯鏡檢術(shù)的專用物鏡，其特點(diǎn)是在物鏡的后焦平面處裝有相板。

（4）無罩物鏡（No cover objective ）: 有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時(shí)應(yīng)使用無罩物鏡，否則圖象質(zhì)量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時(shí)更為明顯。這種物鏡的外殼上常標(biāo)刻ＮＣ，同時(shí)在蓋玻片厚度的位置上沒有０.17的字樣，而標(biāo)刻著“０”。

（5）長工作距離物鏡：這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡，它是為了滿足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設(shè)計(jì)。

二． 目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象（中間象）再放大一便，并把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。

由于不同系列目鏡光學(xué)設(shè)計(jì)不同，所以不能混用。

三． 聚光鏡

聚光鏡又名聚光器，裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。

聚光鏡的的結(jié)構(gòu)有多種，同時(shí)根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑的大小 ，相應(yīng)地對聚光鏡的要求也不同 。

1． 阿貝聚光鏡（Abbe condenser）

這是由德國光學(xué)大學(xué)大師恩斯特。阿貝.(Ernst Abbe)設(shè)計(jì)。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于0.60時(shí)，則色差，球差就顯示出來。因此，多用于普通顯微鏡上。

2． 消色差聚光鏡(Achromatic aplanatic condenser )

這種聚光鏡又名“消色差消球差聚光鏡”和“齊明聚光鏡”它由一系列透鏡組成，它對色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場鏡檢中質(zhì)量最高的一種聚光鏡，其NA值達(dá)1.4 。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4 X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個(gè)視場。

3． 搖出式聚光鏡（ Swing out condenser）

在使用低倍物鏡時(shí)（如4X），由于視場大，光源所形成的光錐不能充滿真整個(gè)視場，造成視場邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場充滿照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。

4． 其它聚光鏡：

聚光鏡除上述明場使用的類型外，還有作特殊用途的聚光鏡。如暗視野聚光鏡，相襯聚光鏡，偏光聚光鏡，微分干涉聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應(yīng)的觀察方式。

四．顯微鏡的照明裝置

顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成，可分為“透射式照明”，和“落射式照明”兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法；后者則適用于非透明的被檢物體，光源來自上方，又稱“反射式或落射式照明”。主要應(yīng)用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。

1． 透射式照明

透射式照明法分中心照明和斜射照明兩種形式：

（1） 中心照明：這是最常用的透射式照明法，其特點(diǎn)是照明光束的中軸與顯微鏡的光軸同在一條直線上。它又分為“臨界照明”和“柯勒照明”兩種。

A． 臨界照明（Critical illumination）:這是普通的照明法。這種照明的特點(diǎn)是光源經(jīng)聚光鏡后成象在被檢物體上，光束狹而強(qiáng)，這是它的優(yōu)點(diǎn)。但是光源的燈絲象與被檢物體的平面重合，這樣就造成被檢物體的照明呈現(xiàn)出不均勻性，在有燈絲的部分則明亮；無燈絲的部分則暗淡，不僅影響成象的質(zhì)量，更不適合顯微照相，這是臨界照明的主要缺陷。其補(bǔ)救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片，使照明變得較為均勻和避免光源的長時(shí)間的照射而損傷被檢物體。

B． 柯勒照明：柯勒照明克服了臨界照明的缺點(diǎn)，是研究用顯微鏡中的理想照明法。這中照明法不僅觀察效果佳，而且是成功地進(jìn)行顯微照相所必須的一種照明法。光源的燈絲經(jīng)聚光鏡及可變視場光闌后，燈絲象第一次落在聚光鏡孔徑的平面處，聚光鏡又將該處的后焦點(diǎn)平面處形成第二次的燈絲象。這樣在被檢物體的平面處沒有燈絲象的形成，不影響觀察。此外照明變得均勻。

觀察時(shí)，可改變聚光鏡孔徑光闌的大小，使光源充滿不同物鏡的入射光瞳，而使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑匹配。同時(shí)聚光鏡又將視場光闌成象在被檢物體的平面處，改變視場光闌的大小可控制照明范圍。此外，這種照明的熱焦點(diǎn)不在被檢物體的平面處，即使長時(shí)間的照明，也不致?lián)p傷被檢物體。

（2） 斜射照明：這種照明光束的中軸與顯微鏡的光軸不在一直線上，而是與光軸形成一定的角度斜照在物體上，因此成斜射照明。相襯顯微術(shù)和暗視野顯微術(shù)就是斜射照明。

2． 落射式照明

這種照明的光束來自物體的上方通過物鏡后射到被檢物體上，這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。這種照明法是適用于非透明物體，如金屬，礦物等。

四． 顯微鏡的光軸調(diào)節(jié)

在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，光源、聚光鏡、物鏡和目鏡的光軸以及光闌的中心必須與顯微鏡的光軸同在一直線上，所以在鏡檢前必須進(jìn)行顯微鏡光軸的調(diào)節(jié)，否則不能達(dá)到最佳觀察效果。

1． 光源燈絲調(diào)節(jié)：舊式顯微鏡需要調(diào)節(jié)燈泡的位置。目前的新型顯微鏡的光源已經(jīng)進(jìn)行了予定心設(shè)置，所以不需要調(diào)整。

2． 聚光鏡的中心調(diào)整：實(shí)際上顯微鏡光軸的調(diào)整的重點(diǎn)即是聚光鏡的位置調(diào)整。

首先將視場光闌縮小，用10X物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌的輪廓，如果不在中央，則利用聚光鏡外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整螺釘將其調(diào)至中央部分，當(dāng)緩慢地增大視場光闌時(shí)，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓象完全與視場邊緣內(nèi)接，說明已經(jīng)和軸。和軸后再略為增大視場光闌，使輪廓象剛好處于視場外切或略大。

3． 孔徑光闌的調(diào)節(jié)：孔徑光闌安裝在聚光鏡內(nèi)，研究用顯微鏡的聚光鏡的外側(cè)邊緣上都有科數(shù)及定位記號，這樣便于調(diào)節(jié)聚光鏡與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，原則上說更換物鏡時(shí)需調(diào)整聚光鏡的數(shù)值孔徑，一般物鏡的數(shù)值孔徑乘0.6或0.8就是聚光鏡的數(shù)值孔徑。

第五章 各種顯微鏡檢術(shù)介紹

前面講述了顯微鏡的光學(xué)原理以及附件，下面將分類介紹一下各類研究用鏡檢術(shù)。在生物研究領(lǐng)域，透射式明場顯微鏡得到廣泛應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上各種特殊的鏡檢方法也得到應(yīng)用，如相襯，熒光，干涉，暗場，這些鏡檢方法在高檔顯微鏡上均能同時(shí)實(shí)現(xiàn)。

第一節(jié) 正立式顯微鏡

一． 明視野觀察（Bright field）

明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應(yīng)用于病理、檢驗(yàn)，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。

二． 暗視野觀察（Dark field）

暗視野實(shí)際是暗場照明發(fā)。它的特點(diǎn)和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象。

暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象，微塵在強(qiáng)光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。

暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。

暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察，最高達(dá)0.02—0.004mm..

三．相襯鏡檢法（Phase contrast）

在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時(shí)，波長和振幅變化不大，在明場觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.

相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡。

相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：

1． 環(huán)狀光闌（Ring slit）: 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。

2． 相板（Phase plate）: 裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，叫“補(bǔ)償面”。有相板的物鏡稱“相襯物鏡”，外殼上常有“Ph”字樣。

相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。

1． 光源要強(qiáng)，全部開啟孔徑光闌；
2． 使用濾色片，使光波近于單色；

四．微分干涉稱鏡檢術(shù)（Differential interference contrast DIC）

微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn)，觀察效果更為逼真。

1． 原理

微分干涉稱鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。

2． 微分干涉稱鏡檢術(shù)所需的特殊部件：

（1） 起偏鏡
（2） 檢偏鏡
（3） 渥拉斯頓棱鏡2 塊

3． 微分干涉稱鏡檢時(shí)的注意事項(xiàng)

（1）因微分干涉襯靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。
（2）具有雙折射性的物質(zhì)，不能達(dá)到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。
（3）倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉襯時(shí)，不能用塑料培養(yǎng)皿。

五 熒光鏡檢術(shù)

熒光鏡檢術(shù)是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。熒光鏡檢術(shù)廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

1．熒光鏡檢術(shù)一般分為透射和落射式兩種類型。

（1）透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。

（2）落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場的均勻照明。

2．熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)

（1） 激發(fā)光長時(shí)間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。
（2）作油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用“無熒光油”。
（3）熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。
（4）電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。

第二節(jié) 偏光顯微鏡（Polarizing microscope ）

一．偏光顯微鏡的特點(diǎn)

偏光顯微鏡是鑒定物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)光學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色發(fā)來進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。

偏光顯微鏡的特點(diǎn)，就是將普通改變?yōu)槠膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。

雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物，化學(xué)等領(lǐng)域。在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。

二．偏光顯微鏡的基本原理

偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件（a）起偏鏡 （b）檢偏鏡 （c）專用無應(yīng)力物鏡 （d）旋轉(zhuǎn)載物臺。

三． 偏光鏡檢術(shù)的方式

（一） 正相鏡檢（Orthscope）:又稱無畸變鏡檢，其特點(diǎn)是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（Bertrand Lens）,同時(shí)為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。

正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。

（二） 錐光鏡檢（Conoscope）：又稱干涉鏡檢，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。

三． 偏光顯微鏡在裝置上的要求

（一） 光源：最好采用單色光，因?yàn)楣獾乃俣?，折射率，和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。
（二） 目鏡：要帶有十字線的目鏡。
（三） 聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。
（四） 伯特蘭透鏡：這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。

四． 偏光鏡檢術(shù)的要求

（一） 載物臺的中心與光軸同軸。
（二） 起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。
（三） 制片不宜過薄。

第三節(jié) 倒置顯微鏡（Inverted microscope）

前面講的是正立式顯微鏡的鏡檢方式，主要用于切片的觀察。而倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)等顯微觀察。

由于上述樣品特點(diǎn)的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿（或培養(yǎng)瓶）中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為“倒置顯微鏡”。

由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的最大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物鏡，因?yàn)榈怪蔑@微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要，也可以選配其它附件，用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。

目前倒置顯微鏡廣泛應(yīng)用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領(lǐng)域。

第四節(jié) 體視顯微鏡（Stereo microscope）

體視顯微鏡又稱“實(shí)體顯微鏡”或“解剖鏡”，是一種具有正象立體感地目視儀器，被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林、工業(yè)及海洋生物各部門。它具有如下地特點(diǎn)：

1． 雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角---體視角（一般為12度---15度），因此成象具有三維立體感；
2． 象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉(zhuǎn)過來的緣故；
3． 雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長
4． 焦深大，便于觀察被檢物體的全層。
5． 視場直徑大。

目前體視鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)是：由一個(gè)共用的初級物鏡，對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開，并成一體視角再經(jīng)各自的目鏡成象，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的，因此又稱為“連續(xù)變倍體視顯微鏡”（Zoom—stereo microscope）。

隨著應(yīng)用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，照相，攝象，冷光源等等。