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發(fā)布日期:2022-10-09 點(diǎn)擊率:75
熒光的原理是某些物質(zhì)會(huì)在高強(qiáng)度的短波長光線照射下,會(huì)發(fā)出波長稍長的發(fā)射光(熒光)。而我們一般都是觀察被激發(fā)熒光基團(tuán)所發(fā)射出來的波長稍長的發(fā)射光(熒光)。
但是激發(fā)的光會(huì)很強(qiáng),所以我們就需要把激發(fā)的光全部濾去,這樣才可以看到熒光基團(tuán)的發(fā)射光(熒光)。
熒光顯微鏡一般都用高強(qiáng)度的汞燈做激發(fā)光源。使用濾色片把不需要的光濾去,只留下激發(fā)熒光集團(tuán)的高強(qiáng)度很純的光線。這個(gè)單色的光線通過物鏡照射到樣本上之后,樣本會(huì)被激發(fā)出發(fā)射光(熒光),熒光和激發(fā)光都會(huì)沿著物鏡光路返回,這樣的話,就需要用一個(gè)二相色鏡把激發(fā)光濾去,只讓我們需要看到的熒光透過。
這個(gè)熒光沿著顯微鏡的光路最后到達(dá)目鏡下,然后進(jìn)入我們的眼睛,我們就可以看到熒光基團(tuán)所發(fā)出來的熒光了。
熒光顯微鏡的預(yù)檢查和調(diào)節(jié):
(1)每次進(jìn)行熒光觀測前,必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設(shè)置等狀況。
(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中,熒光顯微鏡物鏡配置是否得當(dāng),除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3)如同時(shí)進(jìn)行透射光相差觀察,要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵,厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚,約≤10μm為宜。
(5)因照明光源含有紫外線,在載物臺(tái)前上方放一塊棕色遮光板,以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。
(6)電壓不穩(wěn)會(huì)降低高壓汞燈的使用壽命,光源電源加配穩(wěn)壓器。
(7)為延長汞燈壽命,在開啟后15min方可關(guān)閉;汞燈熒光電源一旦關(guān)閉,再次啟動(dòng)至少需等待10min,以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài),否則會(huì)影響燈的壽命。
熒光顯微鏡的像觀察:
(1)在開啟熒光燈源后約5~10min激發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,裝載樣品進(jìn)行觀察;為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會(huì)造成樣品熒光淬滅,先通過縮小熒光顯微鏡的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強(qiáng)度,有規(guī)律地移動(dòng)樣品臺(tái),待確定鏡像后,在調(diào)節(jié)到熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外,可進(jìn)行的必要調(diào)節(jié)措施是:
?、倥懦上窆饴分械恼诠饣蛳薰馄骷?,如DIC附件、ND濾光片等。
②重新調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的收光器對焦和孔徑光闌大小。
?、奂?xì)心調(diào)節(jié)熒光顯微鏡物鏡覆蓋差校正環(huán)。
熒光顯微鏡的應(yīng)用要點(diǎn)
熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像,如果所選激發(fā)波長在肉眼所看不見的近紫外光區(qū)(320~400nm),熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短,光學(xué)分辨率提高。高能量的光子與電子碰撞,使得電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定,會(huì)重新回落到基態(tài),這個(gè)過程中會(huì)消耗部分熱能,并發(fā)出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低,因此波長更長。由于新的光子波長區(qū)別于入射光的光子波長,通過一定的光學(xué)處理方法將兩束不同波長的光分開,從而使我們只看到發(fā)射出來的新光子(熒光信號(hào)),也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。
標(biāo)簽: 熒光顯微鏡
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